秦潔芳1, 2 陳海剛1, 2 蔡文貴1 楊 濤1, 2 賈曉平1
(1中國水產研究院南海水產研究所廣東省漁業生態環境重點實驗室/農業部南海漁業資源環境重點野外科學觀測實驗站廣州510300;2上海海洋大學海洋科學學院,上海201306)
摘 要：實驗室條件下,研究了不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)長期脅迫(15 d)對翡翠貽貝內臟團和外套膜抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT)及脂質過氧化(LPO)水平(以MDA含量表示)的影響,以及受脅迫翡翠貽貝在清潔海水中恢復階段上述生化指標的變化特征.結果表明:脅迫階段, 0·5和2·5 mg·L-1DBP下翡翠貽貝內臟團SOD活性表現為先抑制后逐漸恢復, 12·5和62·5 mg·L-1下則持續受到顯著抑制;不同濃度組CAT活性均明顯被抑制.LPO水平明顯升高.外套膜中, 2. 5mg·L-1下SOD活性受到持續誘導,其他濃度組則先被抑制,后隨曝露時間延長逐漸被誘導;各濃度組CAT的變化波動較大,沒有明顯規律而LPO水平明顯升高.凈化恢復階段, 12·5和62·5 mg·L-1DBP脅迫下的內臟團SOD和CAT活性恢復較慢,其LPO水平隨時間延長逐漸恢復至對照組水平;外套膜中SOD活性呈持續升高趨勢,CAT活性和LPO水平則隨時間延長恢復到對照組水平.
關鍵詞：鄰苯二甲酸二丁酯 翡翠貽貝 超氧化物歧化酶 過氧化氫酶 丙二醛 脂質過氧化
文章編號：1001-9332(2011)07-1878-07 中圖分類號：X52,X592 文獻標識碼 A
2006年,全球增塑劑消費量約665×104,t其中鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalate ester, PAEs)占所使用增塑劑的88%,我國是世界最大的增塑劑消費國之一,PAEs作為增塑劑在我國使用量巨大[1].鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate, DBP)是一種重要的PAEs化合物,是增塑劑中產量和用量最大的一類,同時也可用作油漆、膠粘劑、人造纖維、印刷油墨、安全玻璃、染料、殺蟲劑、化妝品的溶劑和織物潤滑劑等.有研究認為, DBP能抑制胚胎睪丸間質細胞類固醇生成、導致雄性生殖系統畸變,同時作為一種內分泌干擾激素, DBP也具有明顯的遺傳毒性[2].DBP被美國國家環保局列為優先控制的有毒污染物之一,在我國也被列入水體優先控制污染物名單.當前的加工工藝過程中,DBP沒有與高分子碳鏈結合而極易釋放到環境中,對環境安全造成危害.目前,國外水體底泥中的DBP檢出量為0·06 ~2·08mg·kg-1 [3],Huang等[4]對臺灣17條河流底泥中的PAEs進行調查發現, DBP含量在豐水期為0·05~0·22 mg·kg-1,枯水期為0·05 ~1·3mg·kg-1;在黃河干流小浪底和孟津橋水體中DBP的檢出濃度為21·0和4·28μg·L-1 [5],長江武漢段豐水期和枯水期分別為0·16和24μg·L-1 [6].
國內外對DBP毒性研究從20世紀70年代開始不斷受到重視,目前DBP對水生動植物的毒性作用均有報道,主要涉及DBP對藻類、浮游生物和魚類的繁殖、發育的影響以及DBP的富集和降解.研究表明,DBP對藻類生長具有抑制作用并呈現明顯的劑量-效應關系[7],且藻類對DBP存在明顯的富集作用但生物降解作用并不明顯[8].一定濃度的DBP可縮短多刺裸腹溞(Moina macrocopa)的世代時間、提高種群內稟增長率[9],大型溞生長繁殖在低濃度DBP下受刺激而高濃度下被抑制[10]. Patyna和Cooper[11]認為,低濃度的DBP持續曝露將使日本鳉(Oryzias latipes)子代繁殖力明顯下降. DBP對魚的生理生化指標也存在明顯影響.
海洋雙殼貝類分布廣,對有機污染脅迫反應明顯并有極強的蓄積能力,其組織污染物濃度能夠反映環境污染狀況,因此常被用于監測海洋環境污染[12].目前貝類作為試驗生物進行生態毒理學研究主要集中在兩方面: 1)利用貝類對污染物的高富集能力監測化合物的污染水平和在生物體內的蓄積過程, 2)利用其生化指標的敏感性來研究污染物對水生生物的毒性效應.翡翠貽貝(Perna viridis)是生態毒理學研究中的常用貝類,其對PAHs的蓄積量在短期生長個體中最大,且外套膜高于內臟團[13].李曉東等[14]研究表明,翡翠貽貝在三丁基錫脅迫下GST酶發生顯著變化且組織差異明顯.目前國內外尚未見有關DBP對海洋貝類毒性效應的研究.本文研究了DBP對翡翠貽貝內臟團和外套膜生化指標的影響,探討了DBP對翡翠貽貝的毒性效應,為海洋貝類養殖的環境毒理學研究和海洋環境PAEs污染監測提供理論基礎.
1 材料與方法
1·1 儀器和試劑
供試儀器UV-7504單光束紫外可見分光光度計購自江蘇省常州市諾基儀器有限公司,DBP購自廣州化學試劑廠,純度大于99%.以分析純級丙酮助溶制備25 g·L-1儲備液.試驗容器為玻璃鋼材質育苗桶,體積500 L.蛋白質和酶活性測試試劑盒,購于南京建成生物工程研究所.
1·2 試驗動物和曝露條件
試驗用翡翠貽貝購于海南陵水新村港市場,體質量15·58±3·39 g,暫養7 d后選取健康的個體進行試驗.根據預試驗結果將DBP濃度設為0·5、2·5、12·5和62·5 mg·L-1以及溶劑對照組(丙酮<0·001% ),試驗用水量100 L,每組放入55只翡翠貽貝.試驗水溫20·5℃±1·9℃,鹽度36·0±0·3,pH 8·0,晝夜連續充氣.每2 d全部更換試驗用水以保持穩定的試驗濃度,每天定時投喂適量小球藻一次.
1·3 取樣和測定方法
分別于曝露后的0·5(12 h)、1、2、4、8、15 d及移入干凈海水進行恢復2、5、10 d取樣,每組隨機取5只翡翠貽貝,取出內臟團和外套膜,用0·9%預冷生理鹽水淋洗、濾紙吸附后用預冷的Tris-HC1緩沖液(0·01 mol·L-1Tris, 0·25 mol·L-1蔗糖,0·1 mmol·L-1EDTA, pH 7·5)勻漿,組織質量(g) /緩沖液體積(mL)為1/9, 4500 r·min-1離心10 min后,立即取上清液進行蛋白質含量和酶活力測定,LPO水平以MDA含量衡量.蛋白質和酶活性測定按照南京建成生物工程研究所蛋白質試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒使用說明操作.
1·4 數據分析
基于SPSS 13·0采用one-wayANOVA進行單因素方差分析,顯著水平設置在α=0·05.抑制率的計算公式為:抑制率=(1-DBP濃度組/對照組)×100%.
2 結 果
2·1 DBP脅迫對翡翠貽貝內臟團和外套膜SOD活性的影響
2·1·1內臟團SOD活性 與對照組相比, DBP0·5 mg·L-1濃度組在脅迫前4 d SOD活性受到顯著抑制(P<0·05), 8 d開始恢復到對照組水平直到脅迫結束; 2·5 mg·L-1濃度組在脅迫前4 d都受到極顯著抑制(P<0·01),但8 d時恢復到對照組水平, 15 d時極顯著升高(P< 0·01 ); 12·5和62·5 mg·L-1DBP脅迫下SOD活性一直受到極顯著抑制(P<0·01,圖1a).在DBP脅迫過程中, 0·5、2·5、12·5和62·5 mg·L-1濃度組SOD活性在2 d時受到的抑制作用最強烈,抑制率分別為26·0%、44·2%、46·5%和35·1%.表明低濃度DBP致翡翠貽貝內臟團SOD活性先抑制后升高,而高濃度DBP則持續抑制其SOD活性.
DBP脅迫解除并在清潔水體中凈化2 d后,各濃度組翡翠貽貝內臟團SOD活性均恢復至對照組水平;但隨著凈化時間延長,第5天時內臟團SOD活性被顯著誘導并明顯升高;而SOD活性在凈化的第10天顯著降低,并且受到的抑制作用與DBP脅迫濃度呈明顯的劑量-效應關系,其中62·5mg·L-1濃度組的抑制率為44·6%.
2·1·2外套膜SOD活性 在DBP脅迫前2 d,與對照組相比, 0·5、12·5和62·5 mg·L-1濃度組主要表現為受到抑制,而2·5 mg·L-1濃度組則受到顯著誘導(P<0·01); 4 d和8 d時各濃度組在對照組水平波動;脅迫15 d各濃度組SOD與對照相比極顯著升高(P<0·01,圖1b).可以看出, 0·5、12·5和62·5 mg·L-1濃度組的SOD活性在DBP脅迫下表現為先受抑制降低,而后逐漸升高; 2·5 mg·L-1濃度組則一直高于對照;整個DBP脅迫過程中劑量-效應關系并不明顯.
DBP污染解除并在清潔水體中凈化2 d后翡翠貽貝外套膜SOD誘導率顯著降低,并基本恢復到對照水平,但5 d、10 d的SOD活性又顯著升高.說明蓄積在外套膜上的DBP使其SOD活性仍受到影響.
2·2 DBP脅迫對翡翠貽貝內臟團和外套膜CAT活性的影響
2·2·1內臟團CAT活性 如圖2a所示,DBP脅迫開始0·5 d后翡翠貽貝內臟團CAT活性表現為受抑制降低;脅迫1 d后, 0·5、2·5、12·5 mg·L-1濃度組CAT活性比對照組極顯著升高(P< 0·01 ),62·5 mg·L-1濃度組與對照組無顯著差異; 2 d時恢復到對照組水平,其后CAT活性被抑制,到15 d各濃度組CAT活性除2·5 mg·L-1濃度組外都顯著低于對照組(P<0·05).翡翠貽貝內臟團CAT活性在DBP脅迫15 d過程中表現為抑制-誘導-抑制,表明DBP對翡翠貽貝內臟團CAT活性的誘導具有滯后性.DBP對翡翠貽貝內臟團CAT的影響具有較明顯的時間-效應關系,長期的DBP脅迫將抑制CAT活性.
DBP脅迫解除并于清潔水體中凈化2 d后, 2·5和12·5 mg·L-1濃度組CAT活性升高, 5 d后0·5和2·5 mg·L-1濃度組CAT活性升高, 10 d后0·5和2·5 mg·L-1濃度組恢復到對照水平, 12·5和62·5 mg·L-1濃度組則極顯著低于對照(P<0·01).表明低濃度的DBP脅迫后翡翠貽貝內臟團CAT活性在置于清潔水體一段時間后能恢復正常;而高濃度DBP脅迫下即使在DBP污染解除較長時間后翡翠貽貝內臟團CAT活性也難于恢復.
2·2·2DBP外套膜CAT活性 與對照相比,DBP脅迫0·5 d后2·5、12·5和62·5 mg·L-1濃度組翡翠貽貝外套膜CAT活性均表現為受抑制降低; 1 d后2·5和12·5 mg·L-1濃度組CAT活性極顯著升高(P<0·01),其他無顯著變化(P>0·05); 2 d后各濃度組CAT活性再次表現為受抑制;其后在DBP持續脅迫下外套膜CAT活性升高, 15 d后0·5和2·5 mg·L-1濃度組極顯著高于對照組(P<0·01),其他濃度組無顯著變化(P>0·05,圖2b).表明DBP脅迫對翡翠貽貝外套膜CAT活性在脅迫前期波動較明顯,誘導具有一定的滯后性,而后期逐漸平穩,但都表現出顯著的誘導或抑制.
DBP污染解除并于清潔水體中凈化后,翡翠貽貝外套膜CAT活性均恢復到對照組水平(P>0·05).表明當DBP污染解除后翡翠貽貝外套膜CAT活性能夠恢復到正常水平.
2·3 DBP脅迫對翡翠貽貝內臟團和外套膜LPO水平的影響
2·3·1內臟團LPO水平 如圖3a所示,DBP脅迫下各濃度組翡翠貽貝內臟團中的MDA含量均有不同程度的增加,但波動較大,規律性不明顯.與對照相比, 0·5 d后0·5 mg·L-1濃度組MDA含量極顯著升高(P<0·01),其他濃度組無顯著變化或低于對照; 1 d后0·5、2·5和12·5 mg·L-1濃度組MDA含量顯著升高(P<0·05), 62·5 mg·L-1濃度組無顯著變化; 2 d后各濃度組MDA含量都低于對照, 4 d后又顯著升高(P<0·05); 8 d后僅12·5和62·5 mg·L-1濃度組MDA含量顯著高于對照;脅迫15 d時各處理組MDA含量除0·5 mg·L-1濃度組外都顯著高于對照(P<0·01).可見DBP脅迫下翡翠貽貝內臟團LPO水平明顯升高,過氧化損傷明顯,但波動性大,時間-效應和劑量-效應都不明顯.
DBP脅迫解除并于清潔水體中凈化后,翡翠貽貝內臟團MDA含量下降,試驗結束時恢復到或低于對照水平.表明DBP脅迫解除后翡翠貽貝內臟團LPO水平可恢復到正常.
2·3·2外套膜LPO水平 如圖3b所示, DBP脅迫0·5 d下翡翠貽貝外套膜MDA含量沒有明顯變化;DBP脅迫1 d后與對照相比,僅12·5 mg·L-1濃度組MDA含量極顯著升高(P<0·01),其他濃度組保持不變;DBP脅迫2 d、4 d后0·5和2·5 mg·L-1濃度組MDA含量顯著高于對照(P<0·05),其他濃度組低于對照或無顯著變化; DBP脅迫8 d后0·5、12·5和62·5 mg·L-1濃度組MDA含量均極顯著高于對照(P<0·01); 15 d后, 2·5和12·5 mg·L-1濃度組MDA含量仍顯著高于對照(P<0·05).表明DBP脅迫中期顯著提高了翡翠貽貝外套膜的LPO水平,氧化損傷嚴重;但脅迫后期LPO水平降低,氧化損傷程度減輕.
DBP污染解除并于清潔水體中凈化2 d,與對照相比, 2·5、12·5和62·5 mg·L-1濃度組MDA含量仍極顯著升高, 5 d、10 d各濃度組MDA含量即恢復到對照水平.表明翡翠貽貝外套膜LPO水平在DBP污染解解除后可恢復到正常,DBP對外套膜造成的氧化損傷消除.
3·討 論
3·1 DBP脅迫下翡翠貽貝體內生化指標的響應抗氧化酶在防御機體氧化損傷中具有重要作用,其中SOD能將氧自由基轉化成H2O2,CAT能進一步將H2O2轉化成水,消除污染物造成的自由基離子損傷.有研究認為,DBP對生物SOD和CAT活性均有抑制作用[15].本研究中長期DBP脅迫下翡翠貽貝內臟團SOD和CAT活性都受到了顯著抑制; 2·5 mg·L-1濃度組外套膜SOD活性一直受到抑制,而其他濃度組在DBP脅迫早期受到抑制、后期被誘導,其CAT活性變化波動較大,但誘導和抑制變化都很明顯.可以看出翡翠貽貝抗氧化酶防御系統對DBP脅迫產生抗氧化壓力做出了應激反應,且反應明顯,但不同的抗氧化酶變化存在差異.蔡立哲等[16]研究PAHs對菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippi-narum)抗氧化酶活性的影響時發現, PAHs對SOD和CAT活性的影響均表現為先誘導后抑制.翡翠貽貝體內SOD和CAT活性的變化符合生物免疫機能的作用規律:首先由于DBP脅迫初期翡翠貽貝抗氧化應激作用的延遲, SOD和CAT活性尚未被誘導使酶蛋白被破壞或消耗從而導致抗氧化酶活性降低;之后隨著DBP脅迫時間的延長,生物體產生的氧自由基逐漸超出了其自我代償能力導致相關酶活性下降.本研究中SOD和CAT活性的變化沒有明顯的同步性,這可能與兩種酶的受影響模式不同有關.SOD歧化O2-·產生的H2O2并不是完全由CAT還原,GPx也可將其還原,且此途徑也不是H2O2的唯一來源,氨基酸或細胞色素P450氧化酶激活也可產生H2O2[17].
MDA是脂質過氧化的主要產物之一,其含量的高低可指示生物膜膜脂過氧化的程度,目前已較多地應用于水生生態毒理學研究.谷巍等[18]發現,重金屬作用下魚草(Cabomba caroliniana)活性氧和MDA含量上升,其抗氧化酶系統活性紊亂, LPO水平上升;紀靚靚等[19]發現污染物促進了自由基的產生,使抗氧化酶活性改變,MDA極顯著升高.本研究中翡翠貽貝內臟團和外套膜中MDA含量在DBP脅迫下波動雖然較大,但與對照組相比仍均有明顯升高,至DBP脅迫結束其LPO水平仍表現為升高.陳海剛等[20]研究中,氯化三丁基錫脅迫下黑鯛(Sparusmacrocephlus)鰓SOD活性受抑制而肝臟的受促進,但兩組織的MDA含量起初升高到試驗結束時降低,與本研究結果存在一定差異.無論SOD和CAT活性是受到顯著抑制還是促進,翡翠貽貝組織的LPO水平仍升高,表明DBP脅迫使翡翠貽貝體內氧自由基迅速增加,抗氧化防御體系僅能清除出部分自由基從而緩解其對貽貝造成的部分損傷,余下未能及時清除的自由基對細胞產生了不可逆轉的損害,導致機體LPO水平升高.
污染物濃度不同對機體的損害也不盡相同,往往表現出一定的劑量-效應關系.目前對石油類的研究中,水生生物體內酶活性都呈現不同程度的劑量-效應關系[21].但也有研究認為,不同濃度的有機污染物對機體酶活性影響不顯著,李佳華等[22]研究認為,苦草(Vallisneria spiralis)中MDA和可溶性糖含量以及葉片中葉綠素含量與DBP濃度之間相關關系不顯著.本研究中DBP脅迫下翡翠貽貝的SOD和CAT活性沒有表現出明顯的劑量-效應關系,但從總體來看外套膜SOD活性在時間上表現為先抑制后激活(除外套膜2·5 mg·L-1濃度組),內臟團CAT活性先由于生物的延遲效應受抑制,而后被激活再被抑制,表現出一定的時間-效應關系;2·5 mg·L-1濃度組的抗氧化酶活性與其他濃度組間表現出明顯差異,可能與污染物低劑量脅迫誘導生物體產生的相關應激反應有關. Stebbing[23]認為,機體在毒物低濃度下會出現這種現象,并把這一現象稱為“毒物興奮效應”. Pan等[24]試驗過程中發現,低濃度PAHs脅迫下櫛孔扇貝(Chlamys farreri)血淋巴SOD活性持續上升,高濃度脅迫下SOD活性表現為先升后降. DBP脅迫下翡翠貽貝外套膜CAT活性和MDA含量隨曝露時間的變化呈無規律的波動變化,具體表現為“抑制-誘導”效應、“升高-降低”的反復,王雋媛[25]對斑馬魚(Danio rerio)受萘脅迫的研究中也發現其內臟團抗氧化系統酶出現了如此反復的情況.綜上,翡翠貽貝抗氧化系統的變化可以從三方面解釋: 1)DBP重度和(或)長期脅迫產生的氧化壓力超出了翡翠貽貝個體的調節能力,使抗氧化酶活性降低,抗氧化物減少, LPO水平升高; 2)抗氧化酶防御體系中存在過多的氧化劑,包括抗氧化酶體系中產生的氧化劑,則其體系內的酶活性將受到抑制,如SOD活性會受到過氧化氫的抑制,過氧化氫酶也會受到過多的超氧根離子的抑制[26]; 3)抗氧化酶可受到來自環境條件、試驗生物、污染物性質等方面的影響,其變化可能呈現不同的規律.
3·2 DBP污染解除后翡翠貽貝體內生化指標的響應
機體對污染物脅迫而產生的應激效應一般會隨著脅迫的解除而停止.黃周英等[27]研究認為,三丁基錫(TBT)脅迫下文蛤(Meretrixmeretrix)消化腺SOD活性和MDA含量都明顯升高, CAT活性在初期受到誘導而后無影響,在清水中恢復20 d后各指標恢復到對照組水平.在苯并[a]芘脅迫下褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)抗氧化酶被顯著誘導,隨著脅迫時間延長DNA損傷加重,但脅迫50 d結束后進行20 d的恢復其抗氧化酶和DNA損傷都得到了恢復[28].本研究中,清潔海水凈化期間翡翠貽貝內臟團SOD和CAT活性在12·5和62·5 mg·L-1濃度組中仍受到顯著抑制(P<0·05),但LPO水平恢復到或低于對照;外套膜中的SOD活性表現出上升趨勢,CAT活性和LPO水平則恢復到對照水平,表明DBP脅迫對翡翠貽貝產生的損傷在污染解除后能夠恢復,但由于不同酶的性質不同,其所需的恢復時間也不一樣;外套膜與污染物長時間直接接觸,脅迫解除后其SOD迅速恢復.本試驗SOD活性恢復并持續升高的原因可能由于SOD較敏感,生物體解除曝露后可呈現一定范圍的“過度應激”反應,但其機理有待進一步深入探討.此外,污染解除后,低劑量DBP比高劑量DBP的翡翠貽貝恢復得更快,說明雖然受DBP脅迫15 d后各濃度組翡翠貽貝LPO水平較對照組沒有顯著升高,但從它們的恢復情況來看,低劑量DBP對翡翠貽貝的脅迫程度低于高劑量DBP.綜上,DBP脅迫對翡翠貽貝造成的氧化損傷是可以恢復的,在實際的污染治理中可以通過控制水體中PAEs含量來降低其對水生生物的危害,但長期的PAEs對水生生物造成的可遺傳的毒性破壞則可能是不可逆的,這就需要從根本上解決PAEs污染問題.
3·3 翡翠貽貝不同組織對DBP脅迫響應的差異性
不同的組織由于其生理功能上的差異導致其解毒能力也會不同,因此各種酶在不同組織間的活性存在很大差異.內臟團是貽貝消化道和其他內臟器官的總稱,而外套膜上的粘液細胞作為貝類免疫的第一道防線在防護免疫過程中作用十分重要,但貽貝對有毒物質的排出主要通過血細胞滲出和分泌貝殼進行;另外貽貝為濾食性動物,而水體中的污染物僅有大小適中的能夠進入其體內,那些顆粒較大的則沉淀在外套膜上,導致外套膜上的污染物蓄積較其他組織多[13].陳榮等[29]認為,牡蠣(Ostrea cucul-lata)消化腺的SOD和CAT活性遠高于鰓,且活性隨著石油烴含量的增加而增強.李文英等[30]認為,DBP脅迫下斑馬魚(Brachydanio rerio)不同組織中SOD活性變化的差異也很明顯,內臟團中SOD活性為先抑制后激活總體為抑制,鰓絲中為先激活后抑制總體也為抑制.本研究中,翡翠貽貝內臟團CAT活性顯著高于外套膜,外套膜SOD活性顯著高于內臟團,兩種組織的LPO水平變化近似.表明翡翠貽貝內臟團和外套膜中的抗氧化酶由于組織生理功能的差異而不同,同時對DBP脅迫反應的靈敏性也不同.
總之,抗氧化體系的變化反應了DBP對翡翠貽貝的毒性作用: SOD和CAT活性被明顯誘導(或抑制),MDA含量在DBP脅迫下明顯升高.值得注意的是,抗氧化酶活性的變化是一個動態過程,其變化受到多因素制約,這些因素可以是污染物種類和濃度,也可以是試驗生物、環境條件等;MDA含量也可能因時間累積而升高;翡翠貽貝內臟團和外套膜中的SOD和CAT活性大小和變化規律差異顯著.因此,在考慮利用生理生化指標監測環境中的PAE時需要考慮多方面的條件和因素,篩選出最合理、最具指示性的生物和指標.
參考文獻：略
