秦潔芳1，2，陳海剛1，2，蔡文貴1，楊濤1，2，賈曉平1
（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東省漁業生態環境重點實驗室，農業部南海漁業資源環境重點野外科學觀測實驗站，廣州510300；2.上海海洋大學海洋科學學院，上海201306）
摘要：以紅鰭笛鯛（Lutjanus erythropterus）幼魚為實驗生物，根據急性毒性實驗結果（96 h LC50為10.73 mg·L-1）設置鄰苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）的濃度為0.12、0.60、3.00 mg·L-（1以丙酮為對照），在實驗進行6、12、24、48 h和96 h時，分別檢測肝臟和鰓組織超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，以及腦組織乙酰膽堿脂酶（AChE）活性。結果表明，肝臟組織中的SOD反應靈敏且活性明顯被誘導，低劑量組（0.12、0.60 mg·L-1）SOD活性受到的誘導效應較高劑量組（3.00 mg·L-）1更明顯；與對照組比較，肝組織中MDA含量在DEHP曝露的12 h顯著性升高，但48 h的MDA含量顯著性降低（P<0.01），隨曝露時間呈波動變化。鰓組織中的SOD活性明顯低于肝臟組織，整個過程中表現為先升高后降低的變化規律，其中高劑量組（3.00 mg·L-1）受到的誘導最明顯；與對照組比較，MDA含量12 h后即顯著升高（P<0.01），隨后MDA含量開始下降并圍繞對照組水平上下波動。各劑量組腦組織AChE活性僅在6 h受到抑制，此后受到明顯的誘導作用酶活性升高，24 h達到最大值，并顯著高于對照組（P<0.01），但96 h后恢復到對照組水平，呈明顯的時間-效應關系。以上結果顯示，DEHP對紅鰭笛鯛幼魚組織酶活在實驗濃度下影響顯著，對水生生物存在危害，應對其生態風險加以關注。
關鍵詞：鄰苯二甲酸二乙基己酯；紅鰭笛鯛；超氧化物歧化酶；丙二醛；乙酰膽堿酯酶
中圖分類號：X503.225文獻標志碼：A文章編號：1672-2043(2011)03-0409-07
鄰苯二甲酸二乙基己酯[di-（2-ethylhexyl）ph－thalate，DEHP]作為一種重要的鄰苯二甲酸酯類化合物（phthalate acid esters，PAEs），是目前使用量最大的增塑劑。PVC材料中有30%~50%的DEHP，而全球每年塑料的產量約為1.5億t，并以5%的增長率增長[1]，可見DEHP用量之大。DEHP在塑料中以游離子的形式存在，極容易釋放到環境中，因此環境中DEHP的存在是不容忽視的。目前在國內外各類水體中都檢測出DEHP，我國受污染河流中DEHP含量為0.011~101.1μg·L-1[2-3]；城市湖泊中夏季濃度為0.286~0.681μg·L-1，湖泊懸浮物中更高達25.0~58.9μg·L-1[4]；海河入海口的DEHP濃度為8.10μg·L-1[5]。根據研究，DEHP在水體中的環境風險限量[Environmental risklimits（ERLs）]為0.19μg·L-1[6]，可以看出我國水體中的DEHP含量已經超過了ERLs。DEHP可在環境中不斷遷移，大量的DEHP將進入海洋，海洋生態系統將是環境中DEHP的最終載體。
通過對大鼠的研究發現，DEHP主要毒性包括生殖毒性、胚胎毒性、發育毒性及致癌性[7-8]，而目前，研究DEHP對水生生物的毒性作用主要有DEHP對水生生物繁殖、生長發育及行為活動的影響，DEHP對水生生物的DNA損傷也有研究。Answes Thuren[9]研究發現500μg·L-1DEHP能夠抑制鉤蝦（Gammaruspulex）活動，可能是由于生理損傷引起的。但早期的報道認為1 mg·L-1DEHP對草蝦幼體的存活率和發育都沒有明顯的影響[10]。DEHP脅迫還能夠導致斑馬魚胚胎出現卵黃囊異常、心包腫大、心率緩慢、脊椎和尾部彎曲、色素沉積減少等畸變情況[11]。陳莉等[12]利用體外培養染毒的方式研究了DEHP曝露下1.5 h金鯽魚腦組織DNA損傷情況，表明DEHP對水生生物腦組織具有遺傳毒性作用。徐剛等[13]對浮萍的研究則認為DEHP對浮萍的SOD、CAT活性都產生了抑制。
在有害物質對生物產生結構性的破壞前，利用生物行為、功能、生理、化學變化確定生物所處的污染狀態及潛在危害，為嚴重毒性傷害提供早期預警報告，這是生物環境監測的一個重要內容。雖然自然環境中的DEHP含量已經超過了它的環境閾值，但有關DEHP對水生生物毒性效應的研究在國內還不多見。
因此，本文選用南海常見的經濟魚類———紅鰭笛鯛（Lutjanus erythropterus）作為實驗生物，研究了DEHP脅迫下其幼魚肝臟和腮組織SOD酶活性、MDA含量和腦組織AChE酶活性變化，探討DEHP對海水魚類幼體抗氧化及神經損傷和這些指標對生物受水環境中DEHP脅迫的指示作用。
1·材料與方法
1.1實驗動物
紅鰭笛鯛幼魚體長（37±5）mm，體重（1.94±0.97）g，購自海南陵水縣新村港附近育苗場。暫養7 d后，選取活潑健康幼魚進行正式實驗。實驗期間海水pH值為（7.7±0.1），鹽度為（36±1），溫度為（26.60±0.82）℃。實驗過程中每日定時投喂幼魚飼料，并晝夜曝氧，因此可忽略缺氧對實驗結果的影響。
1.2試劑與儀器
鄰苯二甲酸二乙基己酯[di-（2-ethylhexyl）phtha－late]為分析純，購于廣州化學試劑廠。其他所需藥品均為市購分析純。生化指標測試試劑盒購于南京建成生物工程研究所。實驗過程用海水取自育苗場附近海水，經沉淀池沉淀再經砂濾后待用。實驗容器為玻璃鋼材質育苗桶，體積為500 L，實驗用水量為100 L。反應液吸光值測定使用UV-7504單光束紫外可見分光光度計（江蘇省常州市諾基儀器有限公司）。
1.3實驗方法
1.3.1急性毒性實驗
急性毒性實驗采用靜水法生物測試[14]，根據預實驗結果按等對數間距設5個濃度組（8.00、9.36、10.95、12.82、15.00 mg·L-1，丙酮助溶），同時設1個丙酮對照（丙酮<0.001%）和一個清水空白，每組2個平行，放入10尾魚。實驗開始后6 h作連續觀察，之后每12 h定期觀察，記錄幼魚在12、24、48、72、96 h的活動和死亡情況，并及時撈出死亡個體。
1.3.2酶活性及MDA含量的測定
根據急性毒性實驗結果，設置0.12、0.60、3.00mg·L-（1丙酮助溶）和丙酮對照（丙酮<0.001%）4個濃度組，每組濃度放入45條紅鰭笛鯛幼魚，每48 h完全更換實驗溶液1次以確保水質和穩定的曝露濃度。分別在實驗開始后的0、6、12、24、48 h和96 h從每組各取5尾魚，潔凈海水沖洗擦干后置于冰盤內，快速解剖并分別取其肝臟、鰓和腦組織，用0.86%預冷生理鹽水淋洗、濾紙吸附后用預冷的Tris-HCl緩沖液（0.01 mo·lL-1Tris，0.25 mo·lL-1蔗糖，0.1 mmo·lL-1 ED－TA，pH 7.5）勻漿，6 000 r·min-1離心10 min后，立即取上清液進行蛋白質含量、酶活性和MDA含量測定。肝臟的勻漿比例為1/4、鰓和腦的勻漿比例為1/9（組織質量（g）/緩沖液體積（mL））。生化指標測定按照南京建成生物工程研究所蛋白質試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒和AChE試劑盒的使用說明操作。
1.3.3數據處理 用軟件SPSS13.0采用one-way ANOVA進行單因素方差分析，統計結果用平均值±標準偏差（Mean±SD）表示，顯著水平設置在α=0.05，P<0.05認為具有顯著相關性，P<0.01認為具有極顯著相關性。
2·結果與分析
2.1 DEHP對紅鰭笛鯛幼魚的急性毒性
如表1數據所示，DEHP對紅鰭笛鯛幼魚的24、48 h和96 h的LC50分別為12.03、11.32和10.73 mg·L-1，安全濃度為3.01 mg·L-1，可以看出DEHP對紅鰭笛鯛幼魚的急性毒性值遠大于它在自然水體中的最大溶解度0.003 mg·L-1。
2.2 DEHP對紅鰭笛鯛幼魚肝臟組織和鰓組織SOD酶活性的影響
如圖1可以看出，紅鰭笛鯛幼魚肝組織和鰓組織SOD酶活性都明顯地受到了DEHP誘導。肝臟組織中SOD酶活性情況：（1）在各劑量組中，6 h后稍微波動，24 h后與對照組相比表現為顯著下降，12、48、96h相較于對照顯著升高（P<0.05）；（2）在0.12 mg·L-1和0.60 mg·L-1濃度下，在12 h后即達到最大值，分別為39.11 U·mg-1（protein）和41.92 U·mg-（1protein）；（3）3.00 mg·L-1劑量組48 h后達到最大值，為40.03 U·mg-（1protein）。紅鰭笛鯛幼魚鰓組織SOD酶活性在不同DEHP劑量組下表現出不同的誘導效應：（1）0.12mg·L-1劑量下鰓組織SOD酶活性6 h后被誘導達到最大值15.67 U·mg-（1protein），其后被抑制至實驗結束；（2）0.6 mg·L-1和3.00 mg·L-1劑量組表現為先受抑制降低后誘導升高再抑制降低，與對照組都存在顯著差異（P<0.05），兩劑量組間不同在于0.6 mg·L-1劑量組在48 h表現為受誘導升高，而3.00 mg·L-1劑量組在12 h。可以看出，肝臟組織中的SOD活性顯著高于鰓組織，并且在DEHP脅迫下肝臟組織變化靈敏。
2.3 DEHP對紅鰭笛鯛幼魚肝臟組織和鰓組織MDA含量的影響
從圖2可以看出，在DEHP脅迫下紅鰭笛鯛幼魚肝臟組織MDA含量在前48 h表現為先升高后降低，變化與對照組存在顯著差異（P<0.05），但劑量組間差異不明顯（P>0.05）；96 h時，不同劑量組變化差異較大，0.12 mg·L-1劑量組MDA含量極顯著低于對照組（P<0.01），0.60 mg·L-1劑量組MDA含量與對照組無顯著性差異，3.00 mg·L-1劑量組MDA含量與對照組相比極顯著上升（P<0.01）。DEHP脅迫各階段紅鰭笛鯛鰓組織MDA含量變化明顯：6 h相較于對照組即顯著升高（P<0.05）；12 h各劑量組達到最高值，分別為8.91、4.78、8.51 nmol·mg-（1protein）；隨后各個劑量組MDA含量開始下降，隨著DEHP脅迫持續，MDA含量圍繞對照組上下波動。從中可以看出，紅鰭笛鯛幼魚在DEHP脅迫下鰓組織受到的脂質過氧化作用較肝臟組織更明顯，DEHP脅迫產生的氧自由基在肝臟組織中短時間內可被抗氧化防御酶體系有效的清除，紅鰭笛鯛幼魚正常代謝未受到嚴重影響。
2.4 DEHP對紅鰭笛鯛幼魚腦組織AChE的影響
如圖3所示，在DEHP脅迫下紅鰭笛鯛幼魚腦組織AChE活性受到極顯著影響（P<0.01），不同劑量的DEHP的誘導程度有差異。6 h后AChE活性被抑制，與對照組相比極顯著降低（P<0.01）；12 h后各劑量組AChE活性恢復到對照組水平；24 h后AChE活性升高，并極顯著高于對照組（P<0.01），0.60 mg·L-1劑量組較其他兩劑量組（0.12、3.00 mg·L-1）AChE酶活性更高，這可能是由于3.00 mg·L-1劑量組的誘導作用受到限制；隨著時間的延續，到了48 h后各劑量組又恢復到了對照組水平（P>0.05）；96 h后各劑量組AChE活性略有升高（P<0.05）。
3·討論
生物體內DEHP或其代謝產物可以啟動氧化應激機制而發生脂質過氧化，是可能導致組織損傷和造成毒性效應差異的重要機制之一[15]。紅鰭笛鯛肝臟組織SOD反應迅速靈敏，低劑量組（0.12、0.60 mg·L-）1SOD活性的誘導效應較高劑量組（3.00 mg·L-）1更明顯；MDA含量在實驗前期變化不大，96 h后在高劑量組出現了極顯著升高，為對照組的2.8倍，而低劑量組都較對照組低。李學彬[16]的研究也發現，低濃度的DEHP能夠誘導金鯽魚腦組織和腎組織的SOD活力，而高濃度的DEHP會抑制SOD活力，造成脂質過氧化，MDA含量升高。這種變化的原因可能在于紅鰭笛鯛肝臟組織抗氧化酶能夠平衡低劑量DEHP脅迫下產生的自由基，高劑量的DEHP脅迫超出了肝臟組織的自我代償能力，引起了脂質過氧化。鰓組織中的SOD活性在整個實驗過程中表現為先升高后降低，高劑量組受到的誘導最為明顯；MDA含量在12 h后較對照組分別升高了4.6倍、2.0倍和4.4倍。鰓組織細胞在短時間內受到明顯的損傷，表明鰓組織由于抗氧化酶含量較肝臟組織低，DEHP脅迫下受到的脂質過氧化也較肝臟組織嚴重；另外，作為魚的呼吸器官，鰓組織與水體中的DEHP直接接觸，這使得鰓組織對DEHP脅迫反應較肝臟組織迅速。楊麗華等[17]對鎘脅迫下鯽魚鰓和肝臟SOD活性的研究也得到類似的結果，他們認為Cd能導致“毒物興奮效應”，而鰓和肝臟由于執行的生理功能不同，肝臟組織中的SOD酶活性和敏感性高于鰓。
隨著DEHP曝露濃度的增加，本研究中紅鰭笛鯛體內SOD活性和MDA含量的“劑量-效應”變化規律并不明顯，在很多研究中都有類似發現。曹建萍[18]在研究硝基苯對鯽魚肝臟的氧化損傷時也發現SOD活性和MDA含量在實驗過程中變化明顯，各劑量組存在差異，但不存在明顯的劑量-效應和時間-效應關系。這表明盡管有機污染對水生生物存在氧化損傷，但由于多種因素（污染物種類、靶器官、環境因素等）的影響，氧化損傷的效果不一定表現出明顯的規律性。同時研究還發現，紅鰭笛鯛肝臟和鰓組織的SOD活性和MDA含量隨曝露時間的變化呈無規律的波動變化，具體表現為“抑制-誘導”效應的反復。王雋媛等[19]對斑馬魚受萘脅迫的研究中也發現其內臟團抗氧化系統酶出現了如此反復的情況。引起這些變化的原因可能有兩方面：一是DEHP對重度和（或）長期脅迫產生的氧化壓力超出了紅鰭笛鯛幼魚個體的調節能力，抗氧化酶活性降低，抗氧化物減少；二是抗氧化酶防御體系中若存在過多的氧化劑，包括抗氧化酶體系中產生的氧化劑，其體系內的酶活性將會受到抑制，例如SOD活性將會受到過氧化氫的抑制，過氧化氫酶也會受到過多的超氧根離子的抑制[20]。
AChE是生物神經傳導中一種重要的酶，它能降解乙酰膽堿，終止神經遞質對后膜的刺激作用，保證神經沖動在突觸間正常傳導。本研究中紅鰭笛鯛幼魚腦組織中AChE活性僅在極短的時間（6 h）內受到抑制（抑制率為10%），此時紅鰭笛鯛表現為游動速度減緩，多聚集在一起；6 h后即受誘導活性上升并極顯著高于對照組（P<0.01），AChE活性24 h達到最高值時紅鰭笛鯛游動速度明顯加快，但96 h后活性恢復到對照組水平。而Guimar觔es A T B等[21]研究發現，百敵蟲脅迫下羅非魚腦組織AChE活性8 h后開始被抑制，96 h后AChE活性的抑制率達85%，對生物體的行為也有所影響，但沒有出現AChE受抑制后還能被誘導的情況。上述研究結果表明有機污染物脅迫對水生生物的神經組織存在明顯的毒性作用，這一作用的外在表現大多是幼魚游動、捕食等行為活動的改變；從酶學指標變化的時間-效應關系看，化合物種類對生物體AChE活性的影響效應具有較大差異性，這可能與污染物在生物體內的代謝途徑和能否通過血腦屏障的機制有很大聯系。另外，隨著DEHP曝露濃度增加，紅鰭笛鯛腦組織AChE活性受到的誘導作用的變化規律并不明顯。逯曉波等[15]也發現，短期重復DEHP染毒尚未引起初斷乳大鼠神經行為異常，未引起腦氧化損傷改變。而陳莉等[12]采用體外培養腦細胞染毒的方式，卻觀察到DEHP可導致金鯽魚腦細胞DNA損傷，并呈明顯的劑量-效應關系。這種差異與DEHP進入體內后被迅速降解，在腦組織中不存在或含量較低有關[11]，但其詳細機理有待進一步深入探討。
SOD活性、MDA含量和AChE活性常被用來測定有毒有害物質對機體的損失，AChE作為一種有機磷和氨基甲酸酯農藥毒性評價的標準指標被認為是生態毒理學最早期的分子生態毒理學指標。Kavitha P等[22]研究發現在毒死蜱脅迫96 h后蚊魚內臟SOD活性和腦組織AChE活性都受到了抑制，產生脂質過氧化作用，但持續曝露16~18 d，抗氧化水平恢復到對照組水平，AChE活性恢復則需要21 d以上。本研究中，在DEHP脅迫下，紅鰭笛鯛幼魚肝臟組織SOD活性、鰓組織的脂質過氧化和腦組織AChE活性變化明顯，說明DEHP對紅鰭笛鯛產生了顯著影響；但96 h的DEHP對紅鰭笛鯛脅迫作用減弱，肝臟和鰓組織的SOD活性、MDA含量以及腦組織的AChE活性都趨于恢復到對照組水平，表明本研究中DEHP劑量并沒有超出紅鰭笛鯛自我代償的濃度范圍。由于自然水體中DEHP含量遠低于本研究中所設劑量，從魚體生理生化指標的變化結果可以認為其對水生生物的毒性較低。但DEHP作為一種環境激素，目前已在海洋環境中普遍存在，并且含量還在不斷增加，因此其對海洋生態系統中其他生物的潛在危害、特別是對底棲生物的毒性危害仍需要密切關注。
4·結論
（1）在實驗條件下，DEHP對紅鰭笛鯛幼魚的96 hLC50為10.73 mg·L-1，安全濃度為3.01 mg·L-1。
（2）紅鰭笛鯛幼魚在DEHP脅迫下，96 h內肝臟和鰓組織SOD活性和MDA含量都受到了顯著影響，鰓組織的損傷程度較肝臟組織嚴重。
（3）不同濃度的DEHP對紅鰭笛鯛幼魚腦組織AChE的脅迫效應相似，都表現為先抑制后誘導，96 h內AChE活性恢復到對照組水平，呈明顯的時間-效應關系。
參考文獻：略
